Phasenkontrastmikroskopie (PMC) vs. Differenzial-Interferenz-Kontrastmikroskopie (DIC)

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Was ist Phasenkontrastmikroskopie?

Die Phasenkontrastmikroskopie wurde erstmals 1934 vom niederländischen Physiker Frits Zernike beschrieben. Es ist eine Technik, die verwendet wird, um Kontrast in einer durchscheinenden Probe zu gewinnen, ohne die Probe anzufärben. Die Optik des Mikroskops wandelt die Brechzahlunterschiede der Probe in Helligkeitsunterschiede um. Dadurch erscheint das durchscheinende Objekt heller als der dunkle Hintergrund.

Phasenkontrast wird verwendet, um den Kontrast von lichtmikroskopischen Bildern von transparenten und farblosen Proben zu verbessern. Es ermöglicht die Visualisierung von Zellen und Zellbestandteilen, die mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop schwer zu erkennen wären.

In einem Phasenkontrastmikroskop wird der Bildkontrast auf zwei Arten erhöht: Durch die Erzeugung konstruktiver Interferenz zwischen Streu- und Hintergrundlichtstrahlen in Bereichen des Gesichtsfelds, die die Probe enthalten, und durch Reduzierung der Hintergrundlichtmenge, die die Bildebene erreicht.

Was Sie über Phasenkontrastmikroskope (PCM) wissen müssen

Das Phasenkontrastmikroskop wurde 1934 von Zernike entwickelt.
Das Phasenkontrastmikroskop verwendet zwei Lichtstrahlen ohne Strahlteiler.
Das Phasenkontrastmikroskop arbeitet durch die Detektion scharfer Änderungen des Brechungsindex.

Erzeugt ein Bild durch die unvollständige Trennung von direktem und gebeugtem Licht.
Optisches Schneiden ist in PMC nicht möglich.
Bilder im Phasenkontrastmikroskop sind nicht empfindlich gegenüber der Orientierung der Probe.

Das optische System des Phasenkontrastmikroskops erfordert keine Strahlrekombinierer.
Das Nomarski-Prisma wird im Strahlengang nicht verwendet.
Die volle numerische Apertur der Kondensor- und Objektivlinsen kann wegen des Maskierungseffekts der im Lichtweg verwendeten Phasenplatte nicht genutzt werden.

Keine dreidimensionalen Effekte auf den Bildern.
Hat eine geringe axiale Auflösung.
Es verwendet eine ringförmige Blende und eine Phasenplatte, um Kontrast zu erzeugen.

Bilder aus der Phasenkontrastmikroskopie liefern nur qualitative Daten.
Erzeuge einen ‘Halo’ um die Kanten des Bildes.
Verwendet keinen Polarisator.

Vorteile des Phasenkontrasts

Phasenkontrast erfordert nicht, dass Zellen abgetötet, fixiert oder gefärbt werden.
Kontrastreiche, hochauflösende Bilder
Fähigkeit zur Kombination mit anderen Beobachtungsmitteln wie Fluoreszenz.

Einschränkungen der Phasenkontrastmikroskopie

Phasenbilder sind normalerweise von Lichthöfen um die Umrisse von Details umgeben.
Phasenbilder erscheinen grau, wenn weißes Licht verwendet wird, und grün, wenn ein grüner Filter verwendet wird.
Der Phasenkontrast funktioniert bei dicken Präparaten nicht gut, da Phasenverschiebungen von Bereichen etwas unterhalb oder etwas oberhalb der fokussierten Ebene auftreten. Daher ist diese Methode für dicke Organismen oder Partikel nicht ideal.

Die Phasenringe/Annuli begrenzen die numerische Arbeitsapertur des optischen Systems bis zu einem gewissen Grad, wodurch die Auflösung verringert wird.
Dicke Proben können verzerrt erscheinen.

Was ist ein Differenzial-Interferenz-Kontrast-Mikroskop (DIC)?

Die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie, auch als Nomarski-Interferenzkontrast bezeichnet, wurde erstmals 1955 von Francis Smith beschrieben. Es handelt sich um eine lichtmikroskopische Technik, die auf einem Interferenzprinzip basiert, bei dem zwei kohärente Lichtstrahlen (von derselben kleinen Lichtquelle) und der erzielte Bildkontrast verwendet werden mit Gradienten im Strahlengang.

DIC bringt Kontrast in Bilder von Proben, die bei Betrachtung mit Hellfeldmikroskopie wenig oder keinen Kontrast aufweisen. Die mit DIC erzeugten Bilder haben einen 3D-ähnlichen Effekt, was die Technik ideal für elektrophysiologische Experimente macht.

DIC wird für die Bildgebung lebender und ungefärbter biologischer Proben verwendet, wie z. B. ein Abstrich aus einer Gewebekultur oder einzelnen einzelligen Organismen auf Wasserbasis. Seine Auflösung und Klarheit unter solchen Bedingungen sind unter den üblichen optischen Mikroskopietechniken konkurrenzlos.

Was Sie über Interferenzkontrastmikroskope wissen müssen

Das Differentialinterferenzkontrastmikroskop wurde 1952 von Nomarski entwickelt.

Das Mikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast verwendet zwei Lichtstrahlen mit Strahlteilern.
Das Differentialinterferenzkontrastmikroskop arbeitet durch die Detektion einer kontinuierlichen Änderung des Brechungsindex.
Bild erzeugen durch die vollständige Trennung von direkten und gebeugten Lichtstrahlen.

Durch die hohe axiale Auflösung ist ein optisches Schneiden möglich.
Bilder im Differential-Interferenzkontrast-Mikroskop sind sehr empfindlich gegenüber der Orientierung der Probe.
Das optische System eines Differentialinterferenzkontrastmikroskops erfordert Strahlrekombinierer.

Im Strahlengang werden Nomarski-Prismen verwendet.
DCI-Mikroskope können die volle numerische Apertur von Objektiv- und Kondensorlinsen nutzen.
Bilder haben einen pseudo-dreidimensionalen Effekt.

Hat eine hohe axiale Auflösung.
Verwendet keine Ringmembran und Phasenplatte.
Bilder aus der Differentialkontrastmikroskopie liefern sowohl qualitative als auch quantitative Daten.

An den Rändern des Bildes wird kein „Halo“ erzeugt.
Verwendet einen Polarisator.

Vorteile der Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie

Die Probe erscheint im Kontrast zum dunklen Hintergrund hell.

Beim differentiellen Interferenzkontrast tritt kein Halo-Effekt auf und es kann verwendet werden, um sehr klare Bilder dicker Proben zu erzeugen.
DIC kann zusammen mit digitalen Bildgebungssystemen verwendet werden, um dem Bild eine weitere Definition zu verleihen.

Nachteile der Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie

Das dreidimensionale Bild einer Probe ist möglicherweise nicht genau

Das verbesserte Licht und der Schatten können das Erscheinungsbild des Bildes verzerren.

Unterschied zwischen Phasenkontrastmikroskopie und Differentialinterferenzkontrastmikroskopie in Tabellenform

VERGLEICHSGRUNDLAGE	PHASENKONTRAST-MIKROSKOP	DIFFERENTIAL INTERFERENCE KONTRASTMIKROSKOPIE
Entwicklung	Das Phasenkontrastmikroskop wurde 1934 von Zernike entwickelt.	Das Differentialinterferenzkontrastmikroskop wurde 1952 von Nomarski entwickelt.
Lichtstrahl & Strahlteiler	PMC verwendet zwei Lichtstrahlen ohne Strahlteiler.	Das DIC-Mikroskop verwendet zwei Lichtstrahlen mit Strahlteilern.
Arbeitsprinzip	PCM funktioniert durch die Erkennung von starken Änderungen des Brechungsindex.	Das DIC-Mikroskop arbeitet durch die Detektion einer kontinuierlichen Änderung des Brechungsindex.
Bildproduktion	Erzeugt ein Bild durch die unvollständige Trennung von direktem und gebeugtem Licht.	Bild erzeugen durch die vollständige Trennung von direkten und gebeugten Lichtstrahlen.
Optisches Schneiden	Optisches Schneiden ist in PMC nicht möglich.	Durch die hohe axiale Auflösung ist ein optisches Schneiden möglich.
Bilder	Bilder im PCM-Mikroskop sind nicht empfindlich gegenüber der Ausrichtung der Probe.	Bilder im DIC-Mikroskop sind sehr empfindlich gegenüber der Orientierung der Probe.
Strahlrekombinatoren	Das optische System von PMC erfordert keine Strahlrekombinierer.	Das optische System des DIC-Mikroskops erfordert Strahlrekombinierer.
Nomarski-Prisma	Das Nomarski-Prisma wird im Strahlengang nicht verwendet.	Im Strahlengang werden Nomarski-Prismen verwendet.
Objektiv- und Kondensorlinsen	Die volle numerische Apertur der Kondensor- und Objektivlinsen kann wegen des Maskierungseffekts der im Lichtweg verwendeten Phasenplatte nicht genutzt werden.	DIC-Mikroskope können die volle numerische Apertur von Objektiv- und Kondensorlinsen nutzen.
Dreidimensionales Bild	Keine dreidimensionalen Effekte auf den Bildern.	Bilder haben einen pseudo-dreidimensionalen Effekt.
Axiale Auflösung	Hat eine geringe axiale Auflösung.	Hat eine hohe axiale Auflösung.
Ringmembran	Es verwendet eine ringförmige Blende und eine Phasenplatte, um Kontrast zu erzeugen.	Es verwendet eine ringförmige Blende und eine Phasenplatte, um Kontrast zu erzeugen.
Verwenden	Bilder aus dem PCM liefern nur qualitative Daten.	Bilder vom DIC-Mikroskop liefern sowohl qualitative als auch quantitative Daten.
Halo-Effekt	Erzeuge einen ‘Halo’ um die Kanten des Bildes.	An den Rändern des Bildes wird kein „Halo“ erzeugt.
Polarisator	Verwendet keinen Polarisator.	Verwendet keinen Polarisator.